圖一：在19世紀末，恩斯特•阿貝（Ernst Abbe）對光學(xué)顯微鏡的分辨率限制做出了界定，認為大約是光波長(cháng)的一半，即約為0.2微米。這意味著(zhù)科學(xué)家們可以辨別完整細胞，以及其中一些被稱(chēng)為細胞器的組成部分。然而，他們卻無(wú)法分辨一個(gè)正常大小的病毒或者單個(gè)蛋白質(zhì)。
圖2：在常規光學(xué)顯微鏡中，可以區分線(xiàn)粒體的輪廓，但其分辨率卻無(wú)法超越0.2微米。
圖3：第一張由斯特凡•W•黑爾（Stefan W. Hell）使用STED顯微鏡拍攝而成的圖像。左邊為使用傳統顯微鏡拍攝的大腸桿菌，右邊是使用STED顯微鏡拍攝的同樣的大腸桿菌。STED圖像的分辨率是前者的3倍
圖4：?jiǎn)畏肿语@微鏡原理
圖5：中間圖像為溶酶體膜（lysosome membranes），是埃里克•白茲格（Eric Betzig）首次使用單分子顯微鏡拍攝的圖片之一。從中選取0.2微米的阿貝衍射極限大小顯示在右邊。左邊為用傳統顯微鏡拍攝的圖片，可以看出圖片分辨率提高了很多倍。 2014年度諾貝爾化學(xué)獎授予兩名美國科學(xué)家以及一名德國科學(xué)家，以表彰他們在“超高分辨率熒光顯微技術(shù)方面的貢獻”。來(lái)自美國 霍華德·休斯醫學(xué)研究所的埃里克·本茨格(Eric Betzig)，德國馬克斯普朗克 生物物理化學(xué)研究所的史蒂芬·赫爾(Stefan W. Hell)以及美國斯坦福大學(xué)的威廉·默爾納(William E. Moerner)共同分享了今年的化學(xué)獎。 光學(xué)顯微成像技術(shù)向納米尺度的邁進(jìn) 血紅細胞，細菌，酵母菌以及游動(dòng)的精子。當17世紀的科學(xué)家們第一次在光學(xué)顯微鏡下看到這些活生生的生物現象時(shí)，一個(gè)嶄新的世界在他們的眼前打開(kāi)了。這就是光學(xué)顯微成像技術(shù)的誕生。自那以后，光學(xué)顯微鏡已經(jīng)成為生物學(xué)研究領(lǐng)域最重要的工具之一。其他顯微成像技術(shù)，如電子顯微鏡，都需要進(jìn)行樣品的制備，而這樣的制備過(guò)程會(huì )殺死細胞。 借助分子發(fā)光技術(shù)超越物理極限 然而，長(cháng)期以來(lái)，光學(xué)顯微成像技術(shù)的發(fā)展卻一直受制于一個(gè)物理極限值的約束。1873年，顯微技術(shù)專(zhuān)家Ernst Abbe提出了傳統顯微成像技術(shù)的物理極限值：這種技術(shù)的分辨率將永遠不能超過(guò)0.2微米。這一預言導致在20世紀的絕大多數時(shí)間里，科學(xué)家們都相信光學(xué)顯微成像技術(shù)將永遠無(wú)法讓他們突破到更細微的尺度上(Fig 1)。一些細胞內部的細胞器，如為細胞活動(dòng)提供能量的線(xiàn)粒體，它們的輪廓是可以看到的。但要想進(jìn)一步觀(guān)察更小的對象，如細胞內部單個(gè)分子之間的相互作用則是根本不可能做到的。這就有點(diǎn)像是觀(guān)察一座城市，你可以看到城市里林立的高樓，但卻無(wú)法看清其中生活的居民們進(jìn)進(jìn)出出的日常生活。為了了解細胞的日常運作，科學(xué)家們需要對單個(gè)分子的活動(dòng)進(jìn)行追蹤。 然而Abbe提出的這一物理極限由于今年的諾貝爾化學(xué)獎獲獎人的工作被突破了。從理論上說(shuō)，現在再也沒(méi)有任何障礙，阻止科學(xué)家們對更小尺度上的物體進(jìn)行觀(guān)察了。于是，顯微成像變成了納米顯微成像。 在突破Abbe極限的方案中，有兩種各自獨立發(fā)展出來(lái)的技術(shù)方法。而整個(gè)故事還得從1993年位于芬蘭西南部的一間學(xué)生宿舍里講起。有一天，當史蒂芬·赫爾在翻閱一本量子光學(xué)書(shū)時(shí)，他想到了一個(gè)絕妙的主意。 直面Abbe極限的年輕挑戰者 1990年在海德堡大學(xué)獲得博士學(xué)位之后，史蒂芬·赫爾一直在設想超越一個(gè)多世紀前提出的Abbe極限的方法。想要挑戰一種現存的主流觀(guān)點(diǎn)是令人興奮的。但當時(shí)德國的幾乎所有頂尖科學(xué)家都對他的想法持懷疑態(tài)度，于是赫爾轉而向遙遠的北方尋求支持。芬蘭圖爾庫大學(xué)一名主攻熒光顯微成像技術(shù)的教授給了他在自己研究組里的一個(gè)職位。赫爾堅信一定有著(zhù)可以突破Abbe極限的方法。而當他在一本量子光學(xué)書(shū)中讀到有關(guān)受激發(fā)射的內容時(shí)，一種全新的想法在他的腦海中逐漸成型。2009年時(shí)他曾經(jīng)這樣評價(jià)當時(shí)自己的感受：“當時(shí)，那個(gè)想法吸引了我。我終于有了明確的想要去追求的方向�！� 解決方案：納米尺度的閃光樣品掃描 在芬蘭圖爾庫大學(xué)，赫爾專(zhuān)攻所謂熒光顯微成像學(xué)，這是一種技術(shù)方法，科學(xué)家們借助熒光分子對細胞的局部進(jìn)行成像。比如說(shuō)他們可以利用熒光抗體結合的方法來(lái)觀(guān)察分子DNA。他們利用短暫的閃光激發(fā)該抗體，讓它們在短時(shí)間內發(fā)光。如果抗體與DNA結合了，那么它就會(huì )從細胞的核心部位發(fā)光，因為那里正是細胞核內存儲DNA的位置。通過(guò)這種方法，科學(xué)家們可以判斷某一特定分子的所在位置。但這樣也僅僅是能讓科學(xué)家們確定大團分子，如纏繞糾纏的DNA分子的所在位置。這樣做的分辨率太低，難以區分出特定的DNA鏈。你可以想象一下看到纏繞的紗線(xiàn)，而看不清單根紗線(xiàn)的場(chǎng)景。 而當史蒂芬·赫爾讀到有關(guān)受激發(fā)射的內容時(shí)，他意識到應當有可能制成一種裝置，其使用納米閃光燈掃過(guò)樣品，每次一納米。利用受激發(fā)射原理，科學(xué)家們可以冷卻熒光分子。它們將一束激光束對準一個(gè)分子，后者立即失去能量并變得暗淡。在1994年，史蒂芬·赫爾發(fā)表了一篇文章陳述了自己的這一想法。在這一他設想中的技術(shù)方案，也就是所謂“受激發(fā)射減損技術(shù)”(STED)中計劃采用閃光來(lái)激發(fā)所有的熒光分子，隨后利用另外一次閃光讓所有分子熒光熄滅——那些位于中部位置上納米尺度空間內的除外(圖 2)。當進(jìn)行記錄時(shí)則只記錄下這一部分。讓這一光束掃過(guò)整個(gè)樣品表面，并連續記錄光強信息，就有可能得到一張整體圖像。每次允許發(fā)出熒光的空間區域越小，最后得到的圖像分辨率便越高。于是，從原理上說(shuō)，對于光學(xué)顯微成像的極限再也不復存在了。 在德國研制首臺納米閃光裝置 然而史蒂芬·赫爾的理論文章并沒(méi)有立即在學(xué)術(shù)界引起關(guān)注，但卻足以讓史蒂芬·赫爾在德國馬克斯普朗克生物物理化學(xué)研究所獲得一個(gè)職位，在接下來(lái)的數年里，他將自己的設想逐漸變成現實(shí)：他開(kāi)發(fā)出了STED顯微鏡。2000年，他證明了自己的技術(shù)方法在實(shí)際工作中是可行的。當時(shí)他對大腸桿菌進(jìn)行了攝像，其分辨率是此前任何光學(xué)顯微鏡都從來(lái)未能達到過(guò)的(圖 3)。 STED顯微鏡通過(guò)多次小區域上采集光線(xiàn)并最終形成整體成像圖。與之相反，此次獲獎的第二種技術(shù)方案，即所謂“單分子顯微成像技術(shù)”，則涉及多幅整體圖像的疊加。埃里克·本茨格和威廉·默爾納各自獨立的奠定了這項技術(shù)的基礎。這一技術(shù)的最初故事是從默爾納首次成功探測到單個(gè)微小的熒光分子開(kāi)始的。 默爾納——首次探測到單個(gè)熒光分子 在大多數化學(xué)方法中，比如測量熒光的吸收，科學(xué)家們一般都是同時(shí)對數以百萬(wàn)計的分子同時(shí)進(jìn)行觀(guān)察。這類(lèi)實(shí)驗得到的結果一般代表的是典型或平均分子的情況�？茖W(xué)家們只能接受這樣的結果，因為這是無(wú)法改變的。但長(cháng)期以來(lái)他們都一直夢(mèng)想著(zhù)有朝一日能夠對單一分子進(jìn)行直接的測量，因為更加詳盡和豐富的認識或許能夠帶來(lái)對一些現象，比如疾病發(fā)展過(guò)程更深刻的理解。 于是，在1989年，當默爾納成為世界上首位成功測量單個(gè)熒光分子光吸收的科學(xué)家時(shí)，那是一項偉大的成就。當時(shí)他在IBM位于加州的研發(fā)中心工作。這項實(shí)驗開(kāi)啟了通往新的未來(lái)的大門(mén)，并啟發(fā)大量化學(xué)家將他們的注意力轉向單分子研究，其中一位便是埃里克·本茨格。 8年之后，默爾納朝著(zhù)單分子顯微成像技術(shù)又向前邁進(jìn)了一步，他在此前曾經(jīng)被授予諾貝爾獎的綠色熒光蛋白技術(shù)(GFP)的基礎上進(jìn)行了發(fā)展。 帶著(zhù)開(kāi)關(guān)的小燈泡 1997年，默爾納來(lái)到加州大學(xué)圣迭戈分校，后來(lái)被授予諾貝爾獎獲，GFP技術(shù)的發(fā)明人錢(qián)永佑教授也在這里任職。錢(qián)教授從水母體內分離出發(fā)綠色熒光的蛋白，其重要意義在于它能夠讓活體生物體內細胞的其他蛋白質(zhì)同樣變得可見(jiàn)。運用基因技術(shù)，科學(xué)家們將這些綠色熒光蛋白與其他類(lèi)型的蛋白進(jìn)行耦合。這樣，利用綠色熒光作為標記，科學(xué)家們便能知道那些被標記的蛋白質(zhì)在生物體內所處的位置。 默爾納注意到GFP熒光分子的一種，其熒光可以被隨意的開(kāi)啟或關(guān)閉。當他用波長(cháng)488納米的光線(xiàn)激發(fā)這一蛋白質(zhì)時(shí)，它開(kāi)始發(fā)出熒光，但一會(huì )之后它就熄滅了。此后不管他再使用多少光線(xiàn)去照射它，這個(gè)蛋白質(zhì)的熒光都已經(jīng)死了。然而，此后他發(fā)現，如果使用波長(cháng)為405納米的光線(xiàn)去照射它，那么這個(gè)蛋白質(zhì)又能再次復活并發(fā)出熒光。當該蛋白質(zhì)被再次激活，它會(huì )再次發(fā)出波長(cháng)為488納米的熒光。 默爾納將這些可以被激發(fā)的蛋白質(zhì)融入一種溶膠，使其均勻散布其中，這樣其單個(gè)分子之間的距離就能大于當年Abbe衍射極限所限定的0.2微米的長(cháng)度。由于這些分子被分散了開(kāi)來(lái)，一臺常規的光學(xué)顯微鏡便可以區分來(lái)自單個(gè)分子發(fā)出的熒光——它們就像是帶著(zhù)開(kāi)關(guān)的微小燈泡。有關(guān)這一實(shí)驗的結果被發(fā)表在1997年的一期《自然》雜志上。 通過(guò)這一發(fā)現，默爾納顯示了通過(guò)光學(xué)手段操控單個(gè)分子熒光的可能性。這一結果解決了埃里克·本茨格兩年來(lái)一直困擾著(zhù)他的問(wèn)題。 厭倦了學(xué)術(shù)界，但仍對Abbe衍射極限感到著(zhù)迷 與史蒂芬·赫爾一樣，埃里克·本茨格對于突破Abbe設下的衍射極限非常著(zhù)迷。1990年代初，本茨格正在美國新澤西州貝爾實(shí)驗室開(kāi)展一種名叫“近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡”的研究工作。在近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡中，光線(xiàn)是從極為貼近樣品表面，距離僅有幾個(gè)納米的薄片上發(fā)出的。這種顯微鏡可以突破Abbe的衍射極限，但這一方法也有著(zhù)難以克服的缺陷。比如說(shuō)，其產(chǎn)生的光線(xiàn)作用距離極短，因此難以呈現細胞表面以下的深處結構。 1995年，埃里克·本茨格得出結論，他認為近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡已經(jīng)沒(méi)有多少進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)的空間。除此之外，他也感到自己并不適合學(xué)術(shù)界，因此決定結束自己的學(xué)術(shù)生涯。但他對自己接下來(lái)要去哪里感到迷茫。他從貝爾實(shí)驗室離職了，但有關(guān)Abbe衍射極限的問(wèn)題仍然縈繞在他的腦海之中。在一個(gè)冬日的散步期間，他突然產(chǎn)生了一個(gè)新的念頭：是否有可能利用不同分子的不同特性來(lái)避開(kāi)Abbe衍射極限的問(wèn)題，比如利用那些能夠產(chǎn)生不同顏色熒光的分子？ 受到默爾納和其他科學(xué)家研究的啟發(fā)，埃里克·本茨格此前已經(jīng)利用近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察到了單分子的熒光現象�，F在他開(kāi)始思考這樣一個(gè)問(wèn)題：如果不同的分子發(fā)出不同顏色的熒光，比如紅色，黃色和綠色，那么利用常規顯微鏡是否也有可能達成這樣高的分辨率？他的具體想法是讓顯微鏡每次只記錄一種顏色。如果所有發(fā)出同一種顏色的分子都散布開(kāi)來(lái)，它們之間的間距都超過(guò)Abbe衍射極限所限定的0.2微米，那么這些單個(gè)分子的所謂位置便能夠被非常精確的確定下來(lái)。下一步，當不同顏色下記錄的圖像被疊加在一起，那么此時(shí)得到的圖像分辨率將會(huì )大大超越Abbe衍射極限所限定的水平，而紅色，黃色和綠色的分子即便它們各自之間的距離僅有幾個(gè)納米，此時(shí)將仍然可以被分辨出來(lái)。通過(guò)這種方法，Abbe的衍射極限問(wèn)題就可以被繞開(kāi)了。然而還存在一些實(shí)際問(wèn)題，比如他找不到具有足夠可區分光學(xué)特性的分子。 1995年，埃里克·本茨格在《光學(xué)通報》雜志上報告了自己的理論設想，并在隨后離開(kāi)了學(xué)術(shù)界并到他父親的公司工作去了。 重返學(xué)術(shù)界 有很多年時(shí)間，埃里克·本茨格與學(xué)術(shù)界完全脫離了。但有一天，渴望科學(xué)的種子再次在他身體里萌發(fā)了，于是他的目光再次回到了科學(xué)領(lǐng)域，這一次他注意到了關(guān)于綠色熒光分子的消息。他很快意識到這種可以讓活體細胞內其他蛋白質(zhì)發(fā)光的熒光蛋白質(zhì)或許可以被用來(lái)繞開(kāi)Abbe衍射極限。 真正的突破出現在2005年，這一年他無(wú)意間發(fā)現了一種可以隨意開(kāi)啟或關(guān)閉其熒光的蛋白質(zhì)，跟默爾納在1997年在但分子層面上所觀(guān)察到的情況很像。本茨格意識到這正是實(shí)施10多年前他頭腦中那個(gè)想法所缺少的工具。熒光分子并不一定需要具有不同的顏色，它們只要能在不同的時(shí)間發(fā)出熒光就可以了。 通過(guò)圖像疊加方法突破Abbe衍射極限 短短一年之后，埃里克·本茨格與其他研究激發(fā)熒光蛋白的科學(xué)家們一起，證明了他的技術(shù)方案在實(shí)踐中是可行的。在許多不同的實(shí)驗中，有一項實(shí)驗是將該蛋白質(zhì)與溶酶體外膜結合，這里是細胞的回收站。在光信號刺激下，蛋白質(zhì)發(fā)出熒光，但由于光線(xiàn)非常弱，只有一部分的蛋白質(zhì)發(fā)光。由于數量少，幾乎每個(gè)分子之間的距離都要超過(guò)Abbe衍射極限所限定的0.2微米長(cháng)度。于是，在顯微鏡下，每一個(gè)發(fā)光分子的位置都可以被非常精確的記錄下來(lái)。過(guò)了一會(huì )，等到這些分子的熒光逐漸熄滅之后，研究組再激活另外一組蛋白質(zhì)分子，讓它們發(fā)出熒光。同樣的，只有一部分分子會(huì )發(fā)光，同樣的，記錄下每一次發(fā)光分子的圖像。這一過(guò)程被一再重復。 當本茨格最終將所有這些圖像疊加在一起時(shí)，他得到了溶酶體外膜結構的超高分辨率圖像。這張圖像的分辨率遠遠超出了Abbe衍射極限所限定的值。2006年，他們在《科學(xué)》雜志上發(fā)表了有關(guān)研究結果的論文，這是一項突破性的成就。 探索仍在繼續 這兩種分別由埃里克·本茨格，史蒂芬·赫爾以及威廉·默爾納發(fā)展出來(lái)的技術(shù)方法自那以后已經(jīng)導致多項納米尺度成像科技的誕生，目前已經(jīng)在世界各地得到廣泛應用。目前這三位獲獎人仍然活躍在這里研究領(lǐng)域的第一線(xiàn)，與越來(lái)越多投身這一研究領(lǐng)域的科學(xué)家們一道繼續開(kāi)展工作。當他們將強大的納米成像設備對準組成生命的最微小組件，他們幫助人們獲得了大量最新的知識。史蒂芬·赫爾目前正致力于對神經(jīng)細胞的精密探查，以便更好加深對大腦突觸的理解；威廉·默爾納正在開(kāi)展與亨廷頓綜合征有關(guān)蛋白質(zhì)的研究，而埃里克·本茨格正在努力追蹤胚胎內部細胞分裂的過(guò)程。這些都還只是他們正在從事的大量工作中的幾個(gè)案例。 但有一件事是可以肯定的，那就是2014年度的諾貝爾化學(xué)獎獲得者們已經(jīng)為我們奠定了堅實(shí)的基礎，去追尋人類(lèi)最為重要的知識。 來(lái)源：新浪科技 |
