10大革命性技術(shù):基因編輯更快更準更簡(jiǎn)單

發(fā)布時(shí)間:2014-12-24 10:27    發(fā)布者:李寬
關(guān)鍵詞: 基因編輯 , CRISPR , 革命性技術(shù)
撰文 瑪格麗特·諾克斯(Margaret Knox) 翻譯 馬文靜

  1973年,斯坦利·N·科恩(Stanley N. Cohen)和赫伯特·W·博耶(Herbert W. Boyer)找到了改變生物體基因組的方法,成功將蛙的DNA插入到細菌中。20世紀70年代末,博耶的基因泰克(Genetech)公司對大腸桿菌進(jìn)行基因改造,使其帶有一個(gè)人源基因(這個(gè)基因是人工合成的),最后生產(chǎn)出治療糖尿病的胰島素。很快,加利福尼亞州拉霍亞的索爾克生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)的科學(xué)家培育出了第一只轉基因小鼠。

  20世紀70年代,科學(xué)家就找到了改變生物體基因組的方法,但這些方法不甚精確,并且難以用于量產(chǎn)。因此,很多基因修飾實(shí)驗依然既困難又昂貴。

  現在,一種名叫CRISPR的新技術(shù),也許將徹底革新基因組編輯。這一技術(shù)源自細菌的免疫防御系統,比傳統方法更快速、更便宜、更簡(jiǎn)單。商業(yè)化的CRISPR技術(shù)公司己經(jīng)吸引到了大量資金。

  研究人員已經(jīng)開(kāi)始探索,如何將CRISPR技術(shù)應用于艾滋病、精神分裂癥等多種疾病的治療。然而,因為CRISPR能非常輕易地改變植物、昆蟲(chóng)和人類(lèi)的基因組,倫理學(xué)家擔心這會(huì )引發(fā)一些負面后果。

  基因工程領(lǐng)域取得的這些巨大成就改變了現代醫學(xué)的進(jìn)程。但是,早期的基因改造方法有兩大局限:不甚精確,并且難以量產(chǎn)。那時(shí),DNA插入基因組的行為是隨機的,科學(xué)家只能祈求好運,但愿自己能得到一個(gè)有用的突變。1990年,研究人員取得了跨越式的進(jìn)步。他們設計出能在特定位點(diǎn)對DNA進(jìn)行剪切的蛋白,突破了第一個(gè)局限。但是,每想要修改一段DNA序列,他們都必須設計一個(gè)新的蛋白,這種工作非常耗時(shí),并且十分艱苦。

  時(shí)間終于到了2012年。瑞典于默奧大學(xué)(Ume? University)的埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)和加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的珍妮弗·杜德娜(Jennifer Doudna)領(lǐng)導的研究人員報道,他們在細胞中發(fā)現了一種遺傳機制,能讓科學(xué)家以前所未有的速度編輯基因組,并且過(guò)程十分簡(jiǎn)單。此后不久,哈佛大學(xué)和麻省理工大學(xué)的一個(gè)課題組運用這種技術(shù),一次性地對細胞基因組的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了修改。

  這種先進(jìn)的技術(shù)已經(jīng)加快了基因工程產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,對遺傳學(xué)和醫學(xué)也有深遠的推動(dòng)作用?茖W(xué)家現在只要幾周時(shí)間,就能按需定制出經(jīng)過(guò)基因改造的實(shí)驗動(dòng)物,省去了從前一年的工作量與時(shí)間。目前,研究人員正在運用該技術(shù),探索艾滋病、阿爾茨海默病、精神分裂癥等疾病的治療方法。該技術(shù)將生物體的基因修飾過(guò)程變得相當簡(jiǎn)單與廉價(jià),研究人員和倫理學(xué)家甚至開(kāi)始擔心,這會(huì )催生負面效應。

  這種技術(shù)名叫CRISPR,是“clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats”(即成簇、規律間隔的短回文重復序列)的縮寫(xiě)。利用這種序列,細菌可以對侵襲過(guò)它的病毒產(chǎn)生“記憶”。自從日本科學(xué)家20世紀80年代末發(fā)現CRISPR之后,科學(xué)家就一直在研究這種奇怪的基因序列。然而,直到杜德娜和卡彭蒂耶偶然注意到一種名叫Cas9的蛋白,CRISPR才顯示出它作為基因組編輯工具的巨大潛力。

  RNA的力量


  2011年,杜德娜和卡彭蒂耶在波多黎各圣胡安的一次科學(xué)會(huì )議上相識。他們有很多共同點(diǎn):他們的團隊都在研究細菌防御病毒入侵的機制;他們都已經(jīng)確認,細菌可以記住以前入侵過(guò)自己的病毒的DNA,以此來(lái)識別病毒,當該病毒再次入侵時(shí),它們就會(huì )立刻認出“敵人”。

  那次會(huì )議后不久,卡彭蒂耶和杜德娜決定合作。當時(shí),卡彭蒂耶在于默奧大學(xué)的實(shí)驗室剛剛發(fā)現,鏈球菌似乎會(huì )用Cas9蛋白來(lái)“搗碎”突破其細胞壁的病毒。于是,杜德娜在伯克利的實(shí)驗室,也開(kāi)始探究Cas9蛋白的作用機理。

  很多科學(xué)發(fā)現的背后都有一連串巧事,CRISPR的故事也不例外?ㄅ淼僖畬(shí)驗室的克日什托夫·黑林斯基(Krzysztof Chylinski)和杜德娜實(shí)驗室的馬丁·伊內克(Martin Jinek)在毗鄰的城鎮長(cháng)大,說(shuō)著(zhù)同樣的波蘭方言。杜德娜說(shuō):“他們開(kāi)始通過(guò)Skype聊天。兩人一拍即合,然后就開(kāi)始分享數據、討論做實(shí)驗的想法。這個(gè)項目就這樣正式開(kāi)始了!

  兩個(gè)實(shí)驗室的科學(xué)家都意識到,他們或許可以用Cas9蛋白來(lái)進(jìn)行基因組編輯;蚪M編輯是基因工程中的一種方法,酶是這一過(guò)程中的“分子剪刀”,可以剪切DNA。這種酶名叫核酸酶(nuclease),能在特定的位點(diǎn)切斷雙鏈DNA。DNA斷裂后,細胞會(huì )對斷裂位點(diǎn)進(jìn)行修復。有時(shí),細胞中一些人為導入的基因片段,會(huì )在修復的過(guò)程中插入這些位點(diǎn)。杜德娜和卡彭蒂耶剛開(kāi)始合作的時(shí)候,科學(xué)家如果想改變或關(guān)閉一個(gè)基因,最先進(jìn)的方法,是定制一種能找到特定DNA位點(diǎn)并對其進(jìn)行切割的酶。換句話(huà)說(shuō),每修飾一次基因,科學(xué)家都不得不設計一種新的蛋白,專(zhuān)門(mén)針對想要修飾的DNA序列。

  但杜德娜和卡彭蒂耶意識到,Cas9蛋白——這種鏈球菌用于免疫防衛的酶,會(huì )用RNA來(lái)引導自己找到目標DNA。為了探測作用位點(diǎn),Cas9-RNA復合物會(huì )在DNA上不!皬椞,直到找到正確的位點(diǎn)。這一過(guò)程看似隨機,其實(shí)不然。Cas9蛋白的每次彈跳,都是在搜索同一段短小的“信號”序列。Cas9會(huì )附著(zhù)到DNA上,檢測鄰近的序列是否和充當向導的RNA匹配。這種RNA叫做向導RNA(guide RNA,簡(jiǎn)稱(chēng)gRNA),而只有當gRNA和DNA匹配時(shí),Cas9蛋白才會(huì )對DNA進(jìn)行切割。如果能將這套天然的RNA向導系統利用起來(lái),研究人員在切割DNA位點(diǎn)時(shí),就不用每次都構建一種新的酶了;蚪M編輯可能會(huì )因此變得更簡(jiǎn)單、更便宜,也更有效。

  這個(gè)橫跨大西洋的團隊一起對Cas9蛋白進(jìn)行了幾個(gè)月的研究,并且取得了突破。杜德娜還能清楚地記起那個(gè)時(shí)刻。他們的實(shí)驗室坐落在伯克利校園邊緣一個(gè)綠樹(shù)成蔭的山坡上,對面就是希臘劇院,彼時(shí)還在做博士后研究的伊內克一直那里在對Cas9蛋白進(jìn)行實(shí)驗。一天,他來(lái)杜德娜的辦公室討論實(shí)驗結果。面對伊內克和黑林斯基一直在討論的一個(gè)問(wèn)題,他們陷入了沉思:在自然界中——也就是在鏈球菌體內,Cas9蛋白倚靠的不是一個(gè),而是兩個(gè)RNA,來(lái)引導自己尋找DNA上的正確位點(diǎn)。

  如果在保留其向導功能的前提下,將兩條gRNA整合成一條RNA鏈,結果會(huì )怎么樣呢?如果只需修飾一個(gè)RNA序列,研究人員的工作速度將會(huì )得到極大的提升。gRNA序列與目標DNA序列之間存在精妙的互補關(guān)系,利用這種關(guān)系構建一條gRNA,比定制一個(gè)核酸酶更容易。

  “看著(zhù)這些數據,我們突然就開(kāi)竅了——這種事情經(jīng)常發(fā)生,”杜德娜說(shuō)道,“我們意識到,其實(shí)可以將這些RNA分子設計成一條gRNA。一套由一個(gè)蛋白質(zhì)和一條gRNA組成的系統,就足以成為一個(gè)強大的基因修飾工具。我打了個(gè)寒顫,心想,‘天哪,我要趕快跑到實(shí)驗室去,如果這能成功的話(huà)……’”

  他們真的成功了。結果超出了杜德娜的設想(盡管她本來(lái)就抱有很高的期待)。2012年8月17日,當杜德娜和卡彭蒂耶將他們對CRISPR-Cas9的研究成果公諸于眾時(shí),該領(lǐng)域的科學(xué)家立刻認識到這一技術(shù)的變革性力量,他們都想知道CRISPR-Cas9究竟能做什么,一場(chǎng)全球性競賽由此拉開(kāi)序幕。


CRISPR是怎樣工作的?CRISPR 是細菌的“武器”,它能“搗碎”入侵細菌的病毒的DNA?茖W(xué)家可以利用這套工具,改變他們想要修飾的DNA序列。和從前的基因組編輯方法不同,CRISPR 系統采用一個(gè)通用酶——Cas9 來(lái)執行剪切。研究人員需要做的一切,就是制造一個(gè)gRNA來(lái)引導Cas9,而合成一條RNA,遠比合成一個(gè)酶更加容易。

  快速商業(yè)化


  2013年之前,研究人員一直在嘗試將CRISPR-Cas9應用于植物和動(dòng)物細胞——它們比細菌要復雜得多。在他們看來(lái),這和復活尼安德特人與猛犸象一樣激動(dòng)人心。在哈佛大學(xué),遺傳學(xué)家喬治·丘奇(George Church)領(lǐng)導的團隊用CRISPR技術(shù)來(lái)改變人類(lèi)基因,為疾病的治療提供了多種可能性。

  CRISPR-Cas9很快成為了投資的熱點(diǎn)。一年多以前,杜德娜聯(lián)手丘奇、麻省理工學(xué)院的張峰和其他研究人員,共同成立了愛(ài)迪塔斯醫藥公司(Editas Medicine),他們獲得了4300萬(wàn)美元的風(fēng)險投資,用以開(kāi)發(fā)一類(lèi)新的、基于CRISPR的藥物(該公司還沒(méi)有透露他們首先瞄準的是哪類(lèi)疾病)。2014年4月,獲得2500萬(wàn)美元投資的CRISPR醫療公司(CRISPR Therapeutics)在瑞士巴塞爾和英國倫敦成立,他們的目標也是開(kāi)發(fā)基于CRISPR的疾病療法。愛(ài)迪塔斯醫藥公司和CRISPR醫療公司都需要多年時(shí)間,才能開(kāi)發(fā)出相應的療法,然而,實(shí)驗室的供貨商們已經(jīng)在向世界各地的客戶(hù)銷(xiāo)售可以立即用于動(dòng)物注射的CRISPR材料,并開(kāi)始為客戶(hù)定制經(jīng)CRISPR改造的小鼠、大鼠和兔子。

  今年,我在一個(gè)潮濕的夏日拜訪(fǎng)了位于圣路易斯的SAGE實(shí)驗室(SAGE Labs),它是第一批獲準使用杜德娜的CRISPR技術(shù)來(lái)改造嚙齒類(lèi)動(dòng)物的公司之一。在那里,我能親眼見(jiàn)識CRISPR是如何起作用的。SAGE實(shí)驗室向大約20家頂級制藥公司,以及眾多高校、研究所和基金會(huì )供應實(shí)驗材料。英國劍橋的生物技術(shù)公司地平線(xiàn)發(fā)現集團(Horizon Discovery Group)早前也已獨立涉足CRISPR產(chǎn)品的研發(fā);2014年9月,他們又以4800萬(wàn)美元收購了SAGE實(shí)驗室。SAGE實(shí)驗室位于一個(gè)工業(yè)園區內,建在一條馬路盡頭的一組低矮的辦公建筑里。這里的科學(xué)家收到一個(gè)來(lái)自實(shí)驗室的網(wǎng)上訂單:加利福尼亞州薩克拉門(mén)托(Sacramento)的一個(gè)實(shí)驗室為研究帕金森病,訂購20只敲除了Pink1基因的小鼠。建筑新修的側樓耗資200萬(wàn)美金,里面是為客戶(hù)定制的基因改造大鼠,以及其他經(jīng)CRISPR改造的嚙齒類(lèi)動(dòng)物。這些動(dòng)物生活在超凈、恒溫的籠子里,籠子整整齊齊地放在一起,從地板一直排到天花板。工作人員填寫(xiě)訂單、選出相應的20只大鼠,將它們輕輕地放在盒子里打包,然后空運到加利福尼亞——整個(gè)流程就是這么簡(jiǎn)單。如果有人想要研究精神分裂癥或疼痛控制,也可以這樣訂購實(shí)驗動(dòng)物。

  不過(guò),如果倉庫里沒(méi)有客戶(hù)想要定制的那種動(dòng)物,流程就不一樣了。例如,有一個(gè)客戶(hù)想要研究帕金森病和一種新發(fā)現的可疑基因(或者一個(gè)基因的特定突變)之間的關(guān)系,當他到SAGE實(shí)驗室訂購嚙齒類(lèi)動(dòng)物的時(shí)候,有幾個(gè)選擇。SAGE實(shí)驗室的科學(xué)家能用CRISPR技術(shù)“關(guān)掉”目標基因,制造一個(gè)突變;他們也可以關(guān)掉目標基因,然后再往里插入一個(gè)人源基因。從帕金森病到囊性纖維化,再到艾滋病,許多疾病都和基因突變有關(guān)。過(guò)去,科學(xué)家需要一年時(shí)間,才能培育出這些帶有復雜基因突變的實(shí)驗動(dòng)物。但CRISPR不同于以往的基因組編輯技術(shù)。利用這種技術(shù),研究人員能同時(shí)在細胞內快速地改變多個(gè)基因。培育基因工程動(dòng)物的時(shí)間已因此縮短到幾周。

  SAGE的員工首先使用化學(xué)試劑盒,合成客戶(hù)定制的DNA,以及與這條DNA相匹配的RNA。他們將RNA和Cas9蛋白在培養皿里混合,一套具有基因組編輯功能的CRISPR工具就誕生了。然后他們會(huì )花上大約一周的時(shí)間,用一種外形類(lèi)似于掃描儀的儀器,測試該工具在動(dòng)物細胞內的功能。這種儀器能夠發(fā)射電流,將CRISPR工具注入細胞。進(jìn)入細胞的CRISPR工具會(huì )立刻開(kāi)始工作,對DNA進(jìn)行剪切,進(jìn)行小量的基因插入與刪除。CRISPR并非100%有效:在某些細胞里,它們會(huì )剪切DNA、制造突變,在另一些細胞里則完全不起作用。為了觀(guān)察CRISPR的表現究竟如何,科學(xué)家會(huì )從細胞中收集DNA,將它們集中起來(lái),并將目標位點(diǎn)附近的DNA片段復制多個(gè)拷貝。他們會(huì )對這些DNA進(jìn)行處理與分析,然后查看顯示在電腦屏幕上的分析結果。如果CRISPR成功切開(kāi)目標位點(diǎn),制造出突變,屏幕上就會(huì )顯示出一條模糊的條帶,并且,CRISPR剪切過(guò)的DNA越多,條帶就越明亮。接下來(lái),“戰場(chǎng)”轉移到了側樓的動(dòng)物實(shí)驗室里?茖W(xué)家就是在這里制造出經(jīng)基因改造的胚胎,以及突變過(guò)的嚙齒動(dòng)物。生物學(xué)家安德魯·布朗(Andrew Brown)戴著(zhù)外科手套、身穿藍色的長(cháng)袍、戴著(zhù)套鞋和蓬松的帽子,彎腰伏在解剖顯微鏡前。他用玻璃移液管的尖端吸起一個(gè)大鼠胚胎,然后走到房間的另一頭,將胚胎轉移至另一臺裝有機械手臂的顯微鏡上。他將胚胎放到載玻片上的一滴液體里,固定到臺面上,F在,CRISPR就要發(fā)揮它的魔力了:他用右手控制操縱桿,一只機械手臂將一根空的玻璃針頭扎入胚胎。

  從顯微鏡的目鏡看去,胚胎中來(lái)自雙親的兩個(gè)原核(pronucleus)就像是月球表面的環(huán)形山。布朗輕輕推動(dòng)細胞,直到其中一個(gè)原核移到針尖的旁邊。他點(diǎn)擊電腦鼠標,一滴含有CRISPR的液體從針頭噴出,穿過(guò)細胞膜進(jìn)入細胞。原核立即像一朵快速盛開(kāi)的花一樣膨脹開(kāi)來(lái)。布朗運氣不錯,一個(gè)突變細胞就此誕生了。SAGE實(shí)驗室中有3個(gè)技術(shù)員,他們一周4天、一天300次地重復著(zhù)這項工作。

  布朗將完成注射的大鼠胚胎吸入移液管,移進(jìn)培養皿,存儲在加熱至動(dòng)物體溫的培養箱中。最后,他需要將30~40枚經(jīng)過(guò)修飾的胚胎注射到代孕母鼠體內。20天后,代孕大鼠將懷上5~20個(gè)“孩子”,當這些“孩子”長(cháng)到10天大的時(shí)候,SAGE實(shí)驗室的科學(xué)家將抽取組織樣本,檢測哪個(gè)“孩子”帶有改造過(guò)的基因。

  “這是最令人激動(dòng)的時(shí)候,”布朗說(shuō)道。20個(gè)胚胎中,可能只有1個(gè)能被成功改造,而改造成功的動(dòng)物,就是我們所說(shuō)的種源動(dòng)物(founder animal)。到了這一步,每個(gè)人都會(huì )慶祝一下。在我們看來(lái),SAGE實(shí)驗室的科學(xué)家制造RNA、注射胚胎的方法似乎很簡(jiǎn)單,很多實(shí)驗室也在用同樣的步驟培養基因工程動(dòng)物。正如SAGE的首席執行官戴維·斯莫勒(David Smoller)說(shuō)的那樣,這是可以“量產(chǎn)”的基因組編輯技術(shù)。

  前景與危害


  CRISPR已經(jīng)勇猛地踏上了商業(yè)化的征途,研究人員和商人都在為這種技術(shù)設想新的商業(yè)用途,其中的某些想法甚至有些狂妄。運用這種技術(shù),醫生或許可以在懷孕早期的婦女體內,改造與唐氏綜合征有關(guān)的異常染色體;育種人員可以重新向抗性雜草的基因組中引入對除草劑敏感的基因;我們還可以復活已經(jīng)滅絕的物種。這當然會(huì )讓有些人感到害怕。比如,最近就有一些警告性的頭條報道,將這種技術(shù)形容為“扮演上帝的好方法”,或者“瓶中妖”。這些文章?lián),當我們急于擺脫瘧蚊,太想治好亨廷頓病,或者期望“設計”出更好的嬰兒時(shí),我們也可能是在創(chuàng )造一個(gè)充滿(mǎn)有害新基因的“侏羅紀公園”。

  以哈佛大學(xué)研究人員提出的“滅蚊項目”為例。美國伍德羅·威爾遜國際學(xué)者中心(Woodrow Wilson International Center for Scholars)的生物安全分析師托德·庫伊肯(Todd Kuiken)認為,戰勝瘧原蟲(chóng)是一回事,但要消滅這種寄生蟲(chóng)的載體,卻是完全不同的另一項任務(wù)。如果我們的目標是根除瘧疾這種每年感染兩億人、殺死60萬(wàn)人的疾病,我們就不得不小心,自己是否會(huì )制造出10個(gè)新麻煩!拔覀儽仨毾肭宄,‘我們真要這樣做嗎?’如果答案是‘是’,我們有哪些可用的系統?有什么樣的保障措施?”

  科學(xué)家正在快速行動(dòng),他們希望預見(jiàn)CRISPR技術(shù)最可能的危害,并制定應對措施。2014年7月17日,當哈佛大學(xué)的團隊發(fā)表一篇討論如何用CRISPR消滅瘧蚊的論文時(shí),他們也在呼吁公眾對這一問(wèn)題進(jìn)行討論,他們也指出了基因改造在技術(shù)與監管上的窘境。該團隊的生物倫理學(xué)家讓蒂寧·倫斯霍夫(JeantineLunshof)說(shuō):“CRISPR的發(fā)展如此迅猛,很多人還沒(méi)聽(tīng)說(shuō)過(guò)這種技術(shù),但是我們確實(shí)正在使用它。這是一種新現象!爆F在,在伯克利的創(chuàng )新基因組計劃(Innovative Genomics Initiative)的框架下,杜德娜正在組建一個(gè)團隊,專(zhuān)門(mén)討論應用CRISPR的倫理問(wèn)題。如果對倫理問(wèn)題的擔憂(yōu),撲滅了人們對CRISPR的熱情,后果將是不可想象的。例如,2014年6月,麻省理工學(xué)院的研究人員報道,他們直接從尾部向動(dòng)物體內注射CRISPR,治愈了患酪氨酸血癥(tyrosinemia,一種的罕見(jiàn)肝臟疾病)的成年小鼠。這種疾病由一種突變的酶引起。研究人員向小鼠體內注射了3種gRNA序列和Cas9蛋白,以及突變基因的正確DNA序列。小鼠的每250個(gè)肝臟細胞中,就有1個(gè)插入了正確的基因。接下來(lái)一個(gè)月,被“修正”的肝臟細胞蓬勃生長(cháng),最終取代了1/3的病變細胞——這足以使小鼠擺脫上述疾病。2014年8月,坦普爾大學(xué)(Temple University)的病毒學(xué)家卡邁勒·哈利利(Kamel Khalili)領(lǐng)導的研究人員報道,他們已經(jīng)用CRISPR在數個(gè)人類(lèi)細胞系中對HIV病毒進(jìn)行了剪切。

  自上世紀80年代起,哈利利一直奮戰在對抗HIV/AIDS的前線(xiàn)。對他來(lái)說(shuō),CRISPR是場(chǎng)不折不扣的革命。盡管艾滋病治療已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步,但今天的藥物僅僅能控制病毒,仍然不能根除疾病。不過(guò),運用CRISPR,哈利利團隊已經(jīng)徹底從細胞中清除了HIV的完整DNA拷貝,將受感染的細胞轉化了成無(wú)病毒細胞。并且,除了“清洗”已經(jīng)感染病毒的細胞,CRISPR還可以將一段病毒序列整合進(jìn)未受感染的細胞中,對其進(jìn)行免疫——正如杜德娜和她的團隊在原始的細菌中觀(guān)察到的那樣。你可以將這種手段稱(chēng)作“基因疫苗”。哈利利說(shuō):“這是終極的治療方法,如果你在兩年前問(wèn)我,‘你能精準地切割人類(lèi)細胞中的HIV嗎?’我可能會(huì )說(shuō)這非常困難。但現在,我們做到了!

  本文譯者 馬文靜 是北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生,研究方向為CRISPR的改造及l(fā)incRNA。

--新浪科技

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