磁場(chǎng)控制技術(shù)在微流控中的應用

小融一號

微流控技術(shù)發(fā)展至今，已經(jīng)在包括細胞操控分析、醫學(xué)診斷、生物學(xué)研究等多個(gè)領(lǐng)域顯示了較好的應用前景。作為在微米尺度結構中操控流體的驅動(dòng)力，磁場(chǎng)具有電場(chǎng)和流體動(dòng)力所不具備的優(yōu)勢。磁場(chǎng)力的大小不受通道表面電荷、溶液pH值、離子強度和溫度等條件的限制，而且磁場(chǎng)可以不與通道內的物質(zhì)直接接觸而實(shí)現控制，極大降低了交叉污染的可能。由于磁性粒子與周?chē)�介質(zhì)之間的磁化率有很大差別，因此，利用磁場(chǎng)可以將其方便地與周?chē)�介質(zhì)分離，這一特性使其在微流控芯片分離富集方面的優(yōu)勢顯得尤為突出。隨著(zhù)微電子機械系統(micro electromechanical system， MEMS)技術(shù)的進(jìn)步，在微流控芯片中加工微尺度甚至陣列電磁線(xiàn)圈和磁體成為可能，因此，磁場(chǎng)控制技術(shù)在微流控系統中具有非常廣闊的應用空間。該技術(shù)在近兩年發(fā)展非常迅速，尤其在免疫分析、病原體檢測和分子診斷等領(lǐng)域的應用獨具優(yōu)勢，在本文中，我們將對這一領(lǐng)域的最新進(jìn)展做一介紹。

加工技術(shù)

微流控芯片系統中的磁場(chǎng)控制一般通過(guò)外加磁場(chǎng)、加工集成永磁體或電磁體等方式對微通道中磁性粒子進(jìn)行有效操縱來(lái)實(shí)現。磁性粒子所受到的磁場(chǎng)力可以用式表示：

其中，Δχ是磁性粒子與周?chē)�溶液或介質(zhì)的磁化率差，V是粒子的體積，μ0為真空磁導率， B 是磁感應強度，∇B 為磁場(chǎng)梯度。對于均勻磁場(chǎng)來(lái)說(shuō)，∇B為0，此時(shí)，粒子在磁場(chǎng)中只能被磁化，而不會(huì )受力發(fā)生移動(dòng)。所以，磁性粒子只有在不均勻的磁場(chǎng)中才能夠發(fā)生受力運動(dòng)，而磁感應強度B 在磁場(chǎng)方向隨距離增加是呈指數遞減的。因此，通常為了對微通道中的磁性粒子進(jìn)行精確地操縱和定位，需要磁場(chǎng)盡量接近微通道。無(wú)論永磁體還是電磁體，通過(guò)提高磁感應強度來(lái)得到最大磁場(chǎng)力的努力總是受到材料和現有技術(shù)水平的限制，一個(gè)簡(jiǎn)單有效的辦法就是縮小磁場(chǎng)區域，即提高磁場(chǎng)梯度∇B。對于微流控芯片來(lái)說(shuō)，磁場(chǎng)的尺寸和形狀要盡量與微米級的芯片通道相匹配，于是，基于MEMS技術(shù)的集成磁控器件的加工技術(shù)一直備受關(guān)注。在芯片上加工電磁線(xiàn)圈一般都需要經(jīng)過(guò)多次光刻和電鍍程序。圖顯示了一種電磁線(xiàn)圈的加工過(guò)程，采用光刻技術(shù)在玻璃表面制作出金屬線(xiàn)圈、導線(xiàn)和絕緣層等微結構單元，控制每層金屬薄膜的尺寸和形狀，一般在電鍍之前均要沉積一層金屬作為種子層，金屬層之間通過(guò)SU28光膠或聚酰亞胺進(jìn)行絕緣。Ra2madan等還發(fā)現，在電磁線(xiàn)圈中間加工軟鐵芯，可以大大提高磁場(chǎng)梯度，有利于對磁性粒子的操控，與單純電磁線(xiàn)圈相比，磁場(chǎng)力可提高20倍。

集成磁體的微流控系統可以得到微型化的精準磁場(chǎng)，但是加工工藝過(guò)于復雜，不易實(shí)現。針對這一問(wèn)題，Whitesides等報道了一種在聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane， PDMS)芯片中加工微米級電磁體的簡(jiǎn)單方法，即采用軟光刻方法先在PDMS芯片中加工出微通道，然后灌注液體焊錫，冷卻通電即可產(chǎn)生必要的電磁場(chǎng)。Lin等采用類(lèi)似方法在側通道中充入并固定金屬鎳的磁性微球，在與其僅距25μm的分離通道中形成較強的磁場(chǎng)梯度，實(shí)現對磁珠的分離。此外，與芯片集成化磁體相比，采用施加外加磁場(chǎng)的方法通�？梢缘玫酵瑯佑行У拇艌�(chǎng)作用，而且，具有易于加工和低成本的優(yōu)勢，因此，這類(lèi)方法在磁控微流控系統中的應用非常廣泛。

  

流體控制

泵閥

通過(guò)泵閥來(lái)控制流體是除了分離外，磁場(chǎng)在微流控芯片系統中的另一個(gè)主要功能，其中泵主要有磁流體動(dòng)力(magnetohydrodynamic， MHD)泵，鐵磁流體( ferrofluidic)泵和蠕動(dòng)泵等。MHD泵是利用施加正交的磁場(chǎng)和電場(chǎng)產(chǎn)生的洛倫茲力來(lái)驅動(dòng)液流，適用于任何導電的液體，是較早使用的一種磁驅動(dòng)模式。但MHD泵在工作時(shí)溶液經(jīng)常會(huì )因電解而產(chǎn)生氣泡，影響正常的驅動(dòng)和分析操作。Arumugam等通過(guò)在溶液中加入氧化還原劑，減少了氣泡的產(chǎn)生，并延長(cháng)了電極的使用壽命，而且這種泵需要的電壓比普通直流MHD泵低，水性和非水性的溶液都可以被驅動(dòng)。與MHD 泵相比，鐵磁流體驅動(dòng)只需施加磁場(chǎng)而不需電場(chǎng)，因此系統更加簡(jiǎn)單。鐵磁流體是磁性粒子在水溶液或者有機溶液中形成的穩定懸濁液，同時(shí)具有磁性和流動(dòng)性。其中，鐵磁流體溶液與所運輸溶液必須是不互溶的，因此，當輸運對象為水溶液時(shí)，磁性粒子必須分散在油性溶液中，而微通道表面親疏水性質(zhì)也會(huì )在很大程度上影響鐵磁流體泵的性能。Yobas等還設計了一種旋轉的磁控芯片系統，利用磁場(chǎng)帶動(dòng)不銹鋼滾珠在軌道上滾動(dòng)擠壓PDMS通道，巧妙地實(shí)現了蠕動(dòng)泵的驅動(dòng)功能。此外，還有阻抗泵、氣體泵、微齒輪泵以及利用集成二極管與交變電場(chǎng)相互作用來(lái)實(shí)現驅動(dòng)的磁微流體裝置等。

對于流體動(dòng)力驅動(dòng)的微流控芯片系統來(lái)說(shuō)，加工有效的微閥結構也是至關(guān)重要的，除了Quake課題組早年提出的氣動(dòng)閥外，利用磁場(chǎng)控制微通道的閉合和開(kāi)啟也可以方便地進(jìn)行試劑/樣品的切換，實(shí)現閥的功能，結構更為簡(jiǎn)單靈活。

混合

微米尺度條件下流體通常是層流狀態(tài)，因此，在微通道中如何進(jìn)行有效混合一直是科學(xué)工作者們感興趣的課題。解決的方法之一就是通過(guò)MEMS加工技術(shù)將磁子安置在微通道內，利用磁場(chǎng)帶動(dòng)磁子轉動(dòng)以達到高效混合的目的。但是，三維加工技術(shù)難度較大，不利于普及應用。Nallani等報道了一種傾斜曝光方法，用于加工三維的鐵磁性微轉子。他們利用空氣和SU28折射率不同，讓紫外光以55°角入射，得到傾斜角為31.6°的SU28模具。然后將鐵鎳合金注入制成具有三維結構的磁性轉子，該轉子轉動(dòng)時(shí)可引起液流的三維擾動(dòng)，實(shí)現微尺度下的快速混合。

與加工磁子相比，利用磁珠的運動(dòng)形成不規則流體是一種簡(jiǎn)單有效的進(jìn)行混合的方法。Hu等通過(guò)改變外加磁場(chǎng)頻率使液滴中的磁珠擾動(dòng)并形成不同形式的渦流，從而實(shí)現液滴的快速高效混合。Oh等則利用側通道中一段鐵磁流塞的往復運動(dòng)誘導主通道中流體產(chǎn)生擾動(dòng)，來(lái)進(jìn)行有效地混合。

  

操控

磁珠/細胞的操縱

在微流控芯片系統中對細胞或體積更小的病毒顆粒甚至單分子進(jìn)行精確地操縱一直是科學(xué)家們競相研究的熱點(diǎn)，磁控芯片系統可以方便地通過(guò)磁珠捕獲目標分子，再利用磁場(chǎng)進(jìn)行精確控制。

為了降低電磁場(chǎng)所需電流并形成有效的磁場(chǎng)梯度，Wang等在芯片上制作了4條銅導線(xiàn)，并將整個(gè)芯片置于永磁鐵上，通過(guò)控制銅線(xiàn)電流可以選擇性地操控單個(gè)磁珠。Latham等則通過(guò)外加磁場(chǎng)實(shí)現納米磁珠在雙層正交微通道間的連續切換進(jìn)樣，進(jìn)樣量和速度均可控制。

一些細胞具有天然的磁性，如紅細胞、白細胞等，因此利用磁控芯片系統可直接對其進(jìn)行操縱。Krichevsky等將磁帶的磁頭進(jìn)行改進(jìn)，利用其在空間產(chǎn)生的高梯度磁場(chǎng)來(lái)捕獲和分選磁性細菌，并利用內置的自旋閥傳感器進(jìn)行檢測。對于大部分本身不具有磁性的細胞，可以將其吸附到功能化的磁珠表面后進(jìn)行操控。Koschwanez等在PDMS芯片上直接沉積錐形結構的鎳鈷硼合金，在外界小型永磁體的作用下磁化，可捕獲單個(gè)酵母細胞。Lee等在微流控芯片上加工由一系列微線(xiàn)圈構成的集成電路，可快速調整磁場(chǎng)強度和模式，同時(shí)控制多個(gè)細胞。此外， Chiou等還利用微流控芯片集成電磁線(xiàn)圈實(shí)現對單個(gè)DNA分子的拉伸和旋轉等操作。

液滴的操控

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的微液滴技術(shù)具有樣品消耗少、低污染、混合快等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的微反應器。利用磁場(chǎng)可以在油相或超疏水的表面操控含有磁性物質(zhì)的液滴，通過(guò)施加外磁場(chǎng)可以方便地控制液滴移動(dòng)，依次完成運輸、混合、反應及在不同溫區間往復移動(dòng)等操作。Lehmann等利用印刷電路板(p rinted circuit board，PCB)加工成微線(xiàn)圈，如圖所示，他們在微線(xiàn)圈上面涂覆一層局部親水的疏水Teflon膜，于是可以在Teflon表面形成固定位點(diǎn)的水溶液滴，這些液滴分別含有細胞裂解液、雜交液和洗脫液等成分。接著(zhù)，通過(guò)二維磁場(chǎng)控制含有磁性微球的液滴依次經(jīng)過(guò)這些液滴，完成吸附、清洗和洗脫等步驟，實(shí)現核酸提取和酶反應等操作。

Wang等利用磁場(chǎng)和電潤濕作用對液滴中的磁珠進(jìn)行富集和分離，效率可以達到90%以上。Haguet等甚至可以對懸浮液滴進(jìn)行操縱，含有反磁性物質(zhì)的液滴在永磁體微槽中，可以懸浮在空氣中，并沿著(zhù)軸向，在垂直交叉的槽內移動(dòng)。利用磁場(chǎng)對液滴進(jìn)行操控具有選擇性強、方便靈活等特點(diǎn)，因此，這一方法可能成為微液滴操縱的一個(gè)有效的手段，而高集成度的微電磁線(xiàn)圈陣列則可能成為構建高通量微液滴反應器的基本平臺。

磁分離

磁珠/細胞分離

使磁場(chǎng)與微通道的距離盡量縮短以及形成盡可能大的磁場(chǎng)梯度是得到足夠磁場(chǎng)力對粒子進(jìn)行操控的最有效手段，因此，對于外加磁場(chǎng)的微流控系統來(lái)說(shuō)，通常需要將磁體集成到芯片上，以盡可能接近微分離通道。芯片集成電磁線(xiàn)圈通常由于功率限制不能夠施加很高的電流，磁力比較弱，有時(shí)還需要外加磁場(chǎng)的輔助。針對上述問(wèn)題， Xia等在芯片主通道一側電鍍NiFe層，可產(chǎn)生高梯度磁場(chǎng)，該芯片通道為Y型，當磁珠標記的細胞從離磁場(chǎng)較遠處的進(jìn)口引入時(shí)，細胞就會(huì )由于磁場(chǎng)作用而偏離原來(lái)的方向，從另一個(gè)出口流出，得到有效的分離。Kim等和Shih等也采用了類(lèi)似的芯片設計，分別用于分離凋亡T淋巴細胞和病毒顆粒。Liu等通過(guò)精確控制磁場(chǎng)的頻率，對不同直徑的磁珠進(jìn)行了分離。Qu等則利用紅細胞和白細胞本身的順磁性和反磁性，分離了全血中的這兩種細胞。

核酸提取

利用磁性微球表面修飾特定的功能化基團分離核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的技術(shù)已經(jīng)發(fā)展得相當成熟，并得到了非常廣泛的應用。因此，這一技術(shù)也被諸多課題組用于微流控芯片中提取微量核酸樣品。微流控芯片上進(jìn)行DNA提取一般先將細胞破膜，釋放出的DNA被吸附在功能化的磁珠表面，再利用外界磁場(chǎng)將磁珠固定，細胞膜及其他物質(zhì)都被清洗液沖走，最后將DNA洗脫進(jìn)行PCR 擴增等操作。

Lee等設計了簡(jiǎn)單的單通道芯片結構，使用808nm激光束使細胞快速破膜，然后用磁珠捕獲了包括E. coli在內的幾種病原體。此后，他們還設計了集成化的病原體檢測芯片，在CD 光盤(pán)上僅用12 min即完成了全血中特異病原體基因的提取。Nakagawa等使用改性的細菌磁性微球提取全血中的DNA， 5μl的全血可以提取165 ng DNA，洗脫約100 ng，萃取效率為60.6%。Dubus等利用磁珠連接的探針與目標DNA配對成雙鏈，再利用一種富含正電荷的熒光高聚物與雙鏈DNA發(fā)生靜電作用，從而對目標DNA進(jìn)行了分離和高靈敏度檢測，檢出限可以達到200拷貝/150μl，與采用PCR擴增方法的水平接近。

利用微流控芯片進(jìn)行核酸提取，需要的細胞數量較少，而且降低了污染，有利于對稀有細胞進(jìn)行分選和分析。

應用

如前所述，表面功能化的磁珠作為固相載體，可以用來(lái)有效地捕獲核酸、蛋白分子、病毒顆粒甚至細胞，已經(jīng)被廣泛地應用于各種生化指標的臨床診斷等領(lǐng)域。而微流控芯片系統具有快速、高效、集成化等特點(diǎn)，兩者結合，有望實(shí)現臨床檢測儀器進(jìn)一步便攜化和微型化，甚至將臨床診斷技術(shù)帶入現場(chǎng)診斷(point-of-care testing， POCT)的時(shí)代。

免疫分析

免疫分析是臨床上常用的檢測方法，磁控免疫芯片系統一般采用非均相免疫體系，以包被了抗體或抗原的微米或納米磁珠為載體，在微通道中固定這些磁珠以捕獲抗原或抗體。采用微流控芯片系統顯著(zhù)改善了常規免疫分析的速度和性能，大大降低了成本和試劑的消耗，一些系統在POCT領(lǐng)域顯示了廣闊的應用前景。磁控免疫芯片的檢測系統也從激光誘導熒光檢測發(fā)展到電化學(xué)傳感器，無(wú)需進(jìn)行熒光標記，系統體積可進(jìn)一步減小，有利于實(shí)現便攜化。

此外， Herrmann等設計了雙通道芯片網(wǎng)絡(luò )，免疫復合物形成與酶反應在不同通道中進(jìn)行，減少了非特異性吸附，降低了背景噪聲，從而將檢測限降低到100 pg/ml水平。Morozov等則將電場(chǎng)和磁場(chǎng)相結合，來(lái)提高系統靈敏度。他們首先利用電泳，使得溶液中的抗原與固定在通道側壁的抗體充分結合，再加入表面功能化的磁珠與抗原結合，利用光學(xué)顯微鏡檢測，最低可以檢測到10^-17 mol/L的鏈霉親和素。

實(shí)現生化分析的現場(chǎng)化和高通量一直是臨床檢測的發(fā)展目標， Tang等設計了4種不同抗體的電極，可以同時(shí)測定甲胎蛋白(AFP)等4種腫瘤標志物。Lacharme等則通過(guò)降低磁場(chǎng)偶極能量使得磁珠在微通道中進(jìn)行自組裝，形成有序的陣列結構，以進(jìn)行免疫分析。

病原體檢測

與免疫分析芯片一樣，便攜式高通量病原體檢測芯片將成為未來(lái)應付大規模突發(fā)性公共衛生事件的有力工具之一。Pipper等設計了通過(guò)磁場(chǎng)操縱液滴來(lái)完成捕獲、釋放、混合、反應、檢測等步驟，對高致病H5N1禽流感病毒進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測，與傳統方法相比靈敏度提高4倍，成本降低至少20倍。Lee等設計了一系列集成磁控芯片系統，通過(guò)連接在磁珠上的抗體識別并捕獲病毒分子，釋放其中RNA，進(jìn)行反轉錄PCR，完成對登革熱病原體的離線(xiàn)檢測。

蛋白組學(xué)

磁控微流控芯片的另一個(gè)應用是用于蛋白質(zhì)的高效酶解。用包被有褐藻酸的磁珠固定胰蛋白酶，在芯片上消化蛋白質(zhì)，可獲得很高的效率，Viovy課題組在這方面做了一系列研究工作。他們在微通道的兩側放置磁鐵，與通道呈30°夾角，使磁力線(xiàn)方向與液流方向平行，表面固定胰蛋白酶的磁珠引入后在磁場(chǎng)作用下會(huì )在通道內自組裝成填充柱結構，隨后引入樣品進(jìn)行酶解。此外， Li等建立了利用功能化磁珠固定胰蛋白酶的芯片酶反應器-MALD I-TOF質(zhì)譜系統，為更加深入的蛋白組學(xué)研究提供了有力的工具。

核磁共振

核磁共振(NMR)是進(jìn)行分子結構鑒定的有效工具之一，近年來(lái)微型核磁線(xiàn)圈探頭的發(fā)展使得NMR檢測的靈敏度又有了顯著(zhù)的提高。Lin等提出一種基于微液滴的NMR檢測技術(shù)，采用納升級分流器可以收集98%的液相色譜儀流分用于NMR檢測，而另外2%用于質(zhì)譜分析，與常規系統相比靈敏度和進(jìn)樣效率均有大幅提高。通過(guò)合理設計，微流控芯片還可以作為化學(xué)反應過(guò)程分析的理想工具。Takahashi等設計了微流控芯片NMR檢測系統的接口，可以方便地用于實(shí)時(shí)監控化學(xué)反應的中間產(chǎn)物。Pines等將遠程NMR檢測方法用于監控非平衡化學(xué)反應過(guò)程中反應單體與產(chǎn)物之間的自旋相干轉移，可以給出更多有關(guān)反應機理的信息。隨后，他們將原子磁力計集成到微流控芯片上，并在零磁場(chǎng)區域進(jìn)行NMR檢測，檢測器外無(wú)需安置螺線(xiàn)管，樣品與檢測器更加接近，靈敏度顯著(zhù)提高。

值得一提的是，不久前Lee等報道了一套完全微型化的NMR芯片系統，包括陣列微流控芯片、集成線(xiàn)圈、NMR電路和經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)化的微型永磁體，整個(gè)裝置可以放進(jìn)上衣口袋。該系統可以同時(shí)檢測5-10 μl樣品中的8種指標，并被成功用于病毒、細胞和疾病標志物的檢測。

綜上所述，磁場(chǎng)控制技術(shù)應用到微流控系統中為后者開(kāi)辟了更為廣泛的發(fā)展空間，提高了微流控系統對各種物質(zhì)進(jìn)行操控的能力，甚至可以實(shí)現單細胞或單分子的捕獲和控制，同時(shí)，也提高了系統的集成化程度。磁場(chǎng)控制技術(shù)在微流控芯片系統中的應用將會(huì )在以下幾個(gè)方向有更廣闊的發(fā)展前景。首先，磁場(chǎng)所具有的獨特分離能力已經(jīng)在傳統樣品處理過(guò)程中顯示了強大的優(yōu)勢，與微流控芯片技術(shù)的結合，使得整個(gè)系統可以處理更少的樣品量，對于稀有標本或臨床檢測具有重要意義;其次，微型化的電磁線(xiàn)圈對于單個(gè)細胞甚至分子具有更高的分辨能力，可以進(jìn)行單細胞或亞細胞器的分離、提純及其分析;目前，磁珠表面功能化技術(shù)日臻成熟，將其應用于微流控芯片技術(shù)中，通過(guò)在各個(gè)微結構中固定具有不同基團的磁珠，可實(shí)現快速、集成、高通量的樣品處理、分離及檢測分析等。

當前，磁場(chǎng)控制微流控芯片系統也面臨一些亟待解決的問(wèn)題：

(1)如何通過(guò)集成電磁線(xiàn)圈程序化地控制磁珠精確定位和移動(dòng)方向及速度，還有待深入研究；

(2)現有的磁控微流控芯片對樣本的處理通量仍然較低，不能夠滿(mǎn)足大規模臨床檢測的需求，因此如何提高芯片單次處理樣本的數量也是將來(lái)努力的方向；

( 3)如何改善現有集成電磁線(xiàn)圈加工工藝，制作具有更高磁場(chǎng)梯度和強度的微磁體，加強工藝標準化和系統穩定性的問(wèn)題，對未來(lái)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展也具有重要的意義。

總而言之，對于多數系統來(lái)講，微型化、自動(dòng)化和高通量仍然是將來(lái)發(fā)展的一個(gè)重要方向，生物分析包括臨床診斷和現場(chǎng)檢測將成為磁控微流控系統發(fā)展的重要突破;此外，在蛋白組學(xué)、細胞分析等領(lǐng)域也將有較大的發(fā)展前景。

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